常用蛋白濃度測定方法的比較
蛋白濃度測定方法有很多種，各種蛋白質(zhì)含量測定的研究也屢見報道。每種方法都有其優(yōu)點和局限性，在蛋白質(zhì)樣品中往往會含有一些化學(xué)試劑，有些化學(xué)試劑會干擾蛋白濃度測定。因此，尋找合適的實驗方法以避免干擾對蛋白濃度測定的準確性至關(guān)重要。基于Lowry法在測定PEG_IL_6樣品時出現(xiàn)大量黃綠色沉淀，尿素對BCA法測定蛋白濃度測定有嚴重干擾，影響結(jié)果準確性，我們試驗了另外兩種方法，并進一步對方法進行了比較分析。
1 材料
Folin酚試劑、考馬斯亮藍G_250及4，4-二羧酸-2，2-二喹啉(BCA)均為Sigma公司產(chǎn)品；總蛋白(BSA)標(biāo)準購自上海生物制品研究所；變性液為大腸桿菌破碎后加入β一巰基乙醇處理的樣品；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。
2 方 法
Lowry法操作參考文獻[4]。磺基水楊酸沉淀法操作參考文獻[5]。Bradford法操作參考文獻[6]，為方便試驗稍作改變，即取0～500 gg／mL的樣品100 L加Bradford試劑2 mL，室溫放置5 min在595 nm波長處測定吸光度。
3 結(jié) 果
3．1 測定原理比較
Lowry法的測定原理為蛋白質(zhì)與堿性硫酸銅作用形成銅-肽鍵絡(luò)合物，后者與色氨酸和酪氨酸共同作用使酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸還原生成藍色化合物；BCA法的測定原理為蛋白質(zhì)價銅離子還原成亞銅離子，后者在堿性溶液中與BCA結(jié)合生成紫紅色絡(luò)合物。Lowry法與BCA法同屬于化學(xué)法。磺基水楊酸沉淀法屬于物理法，Bradford法屬于染料結(jié)合法，即考馬斯亮藍G-250在酸性溶液中呈紅棕色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色，顏色深淺與蛋白濃度呈正比關(guān)系。
3．3 BCA法測定PEG-IL-6蛋白濃度及Bradford法測定變性液中蛋白濃度的結(jié)果分析
對Lowry法測得的IL-6樣品濃度為250 μg／mL，加入PEG修飾后再用BCA法測得的該樣品的濃度為246 μg／mL，說明PEG對BCA法沒有影響。對BCA法測定的包涵體變性液中蛋白濃度為25 mg／mL的樣品用Bradford法測得只有1．59 mg／mL，對照試驗顯示包涵體變性液中的β一巰基乙醇嚴重干擾BCA法，而對Bradford法無影響。由此可見，Bradford法適于檢測包涵體變性液。表2是連續(xù)10次對同一PEG-IL-6樣品用BCA法測定和同一包涵體變性液樣品用Bradford法測定的結(jié)果。
表2 BCA法測定PEG-IL-6和Bradford法測定包涵體變性液中蛋白濃度的重復(fù)性結(jié)果
4．1 蛋白濃度的測定范圍
按照文獻[4-7]所述方法操作，各種方法測定蛋白濃度的范圍如下：Lowry法標(biāo)準蛋白濃度設(shè)置范圍為10～100 g／mL；BCA法標(biāo)準蛋白濃度設(shè)置在20～ 1 000 g／mL時r值仍大于0．998；磺基水楊酸沉淀法標(biāo)準蛋白濃度設(shè)置在50～500 g／mL時，r值才大于0．99，過高則產(chǎn)生的沉淀不易懸浮；Bradford法為31．25～2 000 g／mL。蛋白濃度測定方法的線性范圍取決于所加樣品中的蛋白質(zhì)的摩爾數(shù)與所加試劑中有效化學(xué)成分的摩爾數(shù)之比，而非體積之比，因此，可以通過減少樣品體積來提高檢測范圍的上限。
4．2 影響因素
影響Lowry法測定蛋白的主要因素有某些氨基酸、NH 、兼性離子緩沖液、非離子表面活性劑、蔗糖、含硫化合物；影響B(tài)CA法測蛋白的主要因素有蔗糖、NH4+、尿素、EDTA_7 J，磺基水楊酸沉淀法雖然克服了以上各種因素，但是不同的蛋白所形成的沉淀性質(zhì)差別很大。如本試驗所顯示，用牛血清白蛋白作標(biāo)準測定破傷風(fēng)類毒素和IL-6蛋白含量誤差可超過100％ ，且蛋白濃度越小誤差越大，因此用此法測定蛋白含量時應(yīng)選相同的或性質(zhì)相近的蛋白做標(biāo)準。影響B(tài)radford法的主要因素有甘油、乙酸、去污劑和一些堿性緩沖系統(tǒng)。由于用Lowry法測定PEG-IL-6時會產(chǎn)生黃色沉淀，并且迅速沉淀到管底，無法用分光光度計測得均勻的吸光度。所以，測定PEG-IL-6等PEG化的蛋白濃度時不能采用Lowry法，但可以采用BCA法。包涵體的變性液和復(fù)性液中經(jīng)常會含有尿素和β．巰基乙醇，這些物質(zhì)會干擾BCA法的測定，所以BCA法不適于含有尿素和β．巰基乙醇的變性液中蛋白含量的測定。根據(jù)表1可知，磺基水楊酸沉淀法對每種樣品檢測偏差都較大，因此，沉淀法必須用與樣品同質(zhì)的已知蛋白含量的對照品測定，也不適于檢測PEG-IL-6和變性液蛋白測定。通過表2的結(jié)果顯示，BCA法檢測PEG-IL-6的干擾少重現(xiàn)性高(RSD<5％)，而Bradford法可以不受變性液中的還原性物質(zhì)干擾，對包涵體變性液中的蛋白濃度的檢測比較準確，且重現(xiàn)性好(RSD<5％)。因此，對于PEG-IL-6等PEG修飾后的蛋白濃度測定*好采用BCA法，而對于包涵體變性液這種含有還原性物質(zhì)的樣品，其蛋白濃度測定*好采用Bradford法。